Технологии стабилизированной амплификации. Инновация в технике амплификации нуклеиновых кислот методом ПЦР

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) находит в наше время все более широкое применение.

Помимо увеличения числа копий ДНК и РНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций в генотип, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования и выделения новых генов.

За 28 лет существования метода (американский биохимик Кэри Муллисом открыл его в 1983 году, а в 1993 году он получил за свое открытие Нобелевскую премию) он претерпел изменения, получил большое количество вариаций постановки, автоматизировался и, следовательно, стал гораздо доступнее для рутинных исследований.

Основные компоненты реакции

• Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени
• Полимераза (или смесь полимераз)
• Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ) – материал для синтеза новых цепей ДНК
• Буфер – смесь катионов и анионов для создания необходимых условий для реакции
• Исследуемый образец – подготовленный к анализу материал.

1. Создание условий в лаборатории, препятствующих попаданию сторонних ДНК (в том числе и из воздуха, с кожи сотрудника, из других исследуемых проб) в исследуемый образец.

2. Создание условий для правильного хранения и эксплуатации реагентов, участвующих в реакции (использование холодильников, морозильников, правильность и безопасность разведения реагентов и пр.).

3. Правильный подбор необходимых компонентов реакции.

4. Сложно избежать изменений результатов продуктами амплификации (ампликонами), которые в огромном количестве накапливаются во время реакции и являются идеальными продуктами для реамплификации.

5. Правильность и точность установки температуры на всех стадия реакции.

Все реагенты, участвующие в ПЦР, необходимо хранить при соблюдении температурного режима +2 ÷ +8ºС, а полимеразы необходимо замораживать до -20ºС. С каждым циклом замораживания-размораживания увеличивается возможность деструкции (частичной или полной) данной полимеразы.

Необходимость разведения и смешивания все компонентов реакции многократно увеличивает риск контаминации!

В наших реагентах используется технология STAT NAT, позволяющая проводить реакцию без приготовления вручную реакционных смесей, соответственно, заметно уменьшить риск контаминации.

Уникальностью технологии STAT NAT является запатентованная технология, которая использует новое защитное соединение, способное стабилизовать активность фермента (полимеразы) на длительный период времени без требований к хранению при контролируемой температуре. Данные, полученные при испытаниях на стресс, показывают, что смеси могут храниться в течение не менее одного года при комнатной температуре.

Технология STAT NAT позволяет:

• Включить ферменты (полимеразу Hot Start Taq) напрямую в смеси перед сухой заморозкой.
• Хранить готовые к применению смеси при комнатной температуре в течение долгого времени.
• Производить готовые к применению смеси во флаконах, полосках, или чашках. Смеси выглядят как плотный порошок белого цвета. 1 носитель – 1 реакция.

Перед процедурой постановки ПЦР необходимо всего лишь добавить к готовой смеси специфический праймер и довести до конечного объема 25 мл, далее внести исследуемый материал.

Смесь STAT-NATTM DNA-Mix является лиофилизованной смесью амплификации ДНК, которая позволяет выполнить количественное определение без приготовления вручную реакционных смесей. Конфигурация в небольших лиофилизованных стабильных при комнатной температуре аликвотах минимизирует любые потенциальные риски, возникающие при отборе пипеткой и связанные с контаминацией.

Смесь STAT-NATTM DNA-Mix составлена из оптимизированного реакционного буфера, фермента полимеразы (полимераза Hot Start Tag), магния хлорида и dNTP.

Применение полимеразы Hot Start Tag ингибирует ферментную активность перед началом термического цикла, что позволяет снизить содержание или элиминировать неспецифические продукты.

Все еще остающиеся высокими цены на ПЦР тесты не позволяют допускать ошибок, связанных с неправильной подготовкой к реакции, а, следовательно, занимают драгоценное время опытных сотрудников лаборатории.

Транспортно-логистические проблемы, неправильные условия доставки и крайне ограниченные условия хранения реагентов в лаборатории увеличивают стоимость анализа для пациента и ограничивают метод ПЦР от повсеместного распространения.

Уникальная технология STAT-NAT позволяет сократить риски гибели реагентов, а также сократить необходимость использования опытных сотрудников для постановки ПЦР, что позволяет этому методу получить более широкое распространение как в странах с жарким климатом, так и в местах, где отсутствует достаточная подготовка сотрудников лаборатории, а также имеются логистические проблемы.

Компания "Ламес" является эксклюзивным поставщиком продукции Sentinel Diagnostics в России

Линейка включает в себя следующие позиции:

Публикации:

CCLM – Validation of a New Freeze-Dried PCR Universal Master Mix.

Gramegna1, E. Castiglioni2, A. Moiana1, M. Zanussi3, M. Ferrari2.

1Sentinel CH, Milano, Italy, 2Vita-Salute San Raffaele University, Milano, Italy, 3Diagnostica e Ricerca San Raffaele SpA, Milano, Italy. In progress

Parasitology – Multicentric Malaria trial and evaluation of a new Freeze-dried PCR assay. M. Gramegna1, A. Moiana1, F. Solari Zubiaga2, S. Gatti2.

1Sentinel CH, Milano, Italy; 2 Laboratory of Parasitology, Virology Service - Foundation-IRCCS Policlinico San Matteo – 27100 Pavia (Italy). In progress

Microbiologia Medica (Vol. 25, Issue 2, 2010) – Development of a PCR Test for the diagnosis of Toxoplasma gondii infections.

Moiana Alessia 1, Gramegna Maurizio 1, Genco Francesca 2, Meroni Valeria 2, 3

1 Sentinel CH. SpA, via Robert Koch, 2 – 20152 Milan; 2 Laboratory of Parasitology,

Foundation - IRCCS Policlinico San Matteo, 27100 Pavia; 3 Department of Infectious

Diseases, University of Pavia, 27100 Pavia