Масс-спектрометрия в лабораторной биохимии

Значительный современный прогресс в развитии масс-спектрометрических инструментов и методов анализа, так и возможности вычислительных методов в биоинформатики сделали МС наиболее чувствительным и специфичным и, как следствие, предпочтительным аналитическим методом в биохимии. Однако природа биотехнологических задач требует все более совершенной МС-аппаратуры, способной обеспечить более высокую чувствительность, специфичность и производительность МС-анализов. Биотехнологии работают со сложными смесями (до 10⁶ компонент) в большом динамическом диапазоне концентрации (до 10 ⁶).

До конца 70-х возможности МС-анализа были ограничены методами ионизации. В основном применялся электронный удар, который сам по себе создавал многочисленные фрагменты. Состав фрагментов давал богатую структурную информацию и позволял идентифицировать вещества, сравнивая спектры с известными библиотечными данными. Спектры электронного удара были насыщены пиками, и для анализа смесей было привлекательнее использовать не просто МС, а тандемы ГХ-МС. Газовая хроматография (ГХ) высокого разрешения позволяла разделять компоненты во времени, а масс-спектры электронного удара позволяли идентифицировать индивидуальные компоненты. Показательно, что исследователи предпочитали ГХ-МС-методы даже для расшифровки последовательности белков. Белки подвергались ограниченному кислотному гидролизу, полученные пептиды подвергались химической модификации, переводились в летучее состояние и анализировались ГХ-МС С начала 80-х годов происходит стремительное развитие масс-спектрометрии, вызванное сразу многими причинами: созданием и внедрением методов мягкой ионизации, масс-анализаторов нового типа, подключением методов информатики для обработки данных и разработкой новых областей приложения и методов анализа. Возможности масс-спектрометрии еще более расширились с появлением мягких методов ионизации следующего поколения: электроспрей — ESI и лазерной десорбции / ионизации из матриц — MALDI. К началу 90-х методы MALDI и ESI полностью заместили своих предшественников. Они расширили диапазон анализируемых соединений, привели к существенному улучшению чувствительности и снизили химический фон. Масс-спектры значительно упростились: каждое индивидуальное соединение теперь стало представимым ионами одной массы (учитывая вариации заряда), соответствующей молекулярной массе соединения. Это, наконец, позволило применять (МС-МС)-методы для анализа сложных смесей. Разработка ионного источника Ion Spray при повышенных потоках жидкости позволила надежно стыковать масс-спектрометры с жидкостными хроматографами (LC), что в свою очередь вызвало появление множества фармацевтических приложений.

Метод MALDI с самых первых дней был связан с анализом пептидов, белков и коротких молекул ДНК. Однако метод MALDI так и не смог стать конкурентноспособным в анализе ДНК — он уступает секвенаторам и ДНК-чипам и по чувствительности, и по экспрессности анализа, и по размеру анализируемых молекул. Выяснилось, что молекулярный вес не является ни отличительной, ни стабильной характеристикой белков. Так, в организме человека ожидается до 1 000 000 различных белков, покрывающих диапазон от 10 до 100 кДа, т. е. на одну молекулярную массу в среднем приходится около десяти претендентов. Белки испытывают более 200 разных типов вариаций, как например фосфорилирование или гликозилирование. Таким образом, правильнее отличать белки по их "фамилии, имени и отчеству", а не по весу, поэтому прямые измерения массы ДНК и белков оказались непопулярными. Однако настоящий триумф состоялся в приложении метода MALDI к идентификации белков по пептидным картам, впоследствии ставшей основой методологии протеомики.

Развитие методов мягкой ионизации, успешные приложения масс-спектрометрии в биотехнологии и широкое распространение масс-спектрометрических систем стимулировали лавинообразное развитие (МС-МС)-приборов. В результате появились такие скоростные (МС-МС)-инструменты, как ионные ловушки (ITMS) и тандем Q-TOF. В результате полное (МС-МС)-определение всех компонент смеси может быть проведено приблизительно за 2-3 минуты. Кроме того, при этом повысились разрешающая способность (10 000-20 000) и точность определения масс-фрагментов (1-5 ррш), что резко улучшило достоверность идентификации и пороги обнаружения, определяемые химическим шумом. Приборы Q-TOF гораздо более пригодны для широкого круга задач, и комплекс Q-TOF с микроколоночной хроматографией (pLC- Q-TOF) является одной из основных "рабочих лошадок" для качественного анализа в биотехнологических и фармацевтических приложениях. С помощью pLC-Q-TOF можно определить несколько тысяч компонент в анализируемых смесях на протяжении одночасового анализа. Запись (МС-МС)-спектров хорошо автоматизирована, а типичное время записи единичного МС- или (МС-МС)-спектра составляет около 1 с и диктуется компромиссом между стремлением зарегистрировать максимум компонент, с одной стороны, и чувствительностью прибора и временем интерпретации (МС-МС)-спектров, с другой стороны. Комплексы успешно применяются, например, для идентификации белков в смесях, содержащих несколько сот компонент (представленных десятками тысяч пептидов), или для характеризации комбинаторных лекарственных библиотек Именно в биотехнологических приложениях приходится анализировать сложные смеси в большом диапазоне концентраций компонент и идентифицировать минорные примеси в присутствии сложных биологических матриц (тканей, плазмы крови и т. д.). В результате сложного процесса развития в симбиозе биотехнологические приложения стали основным потребителем (МС-МС), а (МС-МС)-методы — самыми селективными и наиболее достоверными методами анализа в биотехнологии.

Более 20 лет компания Eureka подразделение-Sentinel Diagnostics (Италия) является техническим и научным профессиональным помощником для всех международных лабораторий клинической биохимии, биотехнологии и фармацевтики, использующих аналитическую хроматографию и масс-спектрометрию.

Миссия компании: УПРОСТИТЬ, УЛУЧШИТЬ, СТАНДАРТИЗИРОВАТЬ аналитические процедуры, существующие в специальных лабораториях клинической химии, благодаря ГОТОВЫМ К ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРАМ с использованием хроматографических методов ВЭЖХ, ГХ, ГХ-МС, ЖХ-МС/МС. Компания EUREKA производит самый разнообразный в мире портфель диагностических наборов для специальной клинической химии, терапевтического мониторинга лекарственных средств (TDM), производственной токсикологии и судебной токсикологии для количественного определения эндогенных молекул, лекарственных препаратов, биомаркеров или других веществ в биологической матрице (моча, плазма, сыворотка, слюна, волосы).

Полный набор содержит все реагенты, необходимые для проведения одного хроматографического цикла (буферный раствор, раствор для дериватизации и депротеинизации, внутренние стандарты, калибратор, SPE-колонки, промывочный и кондиционирующий раствор). Один набор позволяет выполнить 50, 100, 200 или 500 тестов и может быть использован в любой традиционной хроматографической системе. Все наборы Eureka имеют маркировку IVD и CE.